（1）斑马鱼的养殖
选用的斑马鱼（AB 系，5 月龄），养殖系统的水温控制在 28 ± 1 ℃，养殖水的pH 值控制在 7.5 ± 1.0，电导率为 500 - 800 μS/cm。光周期为 14：10 小时（光：暗），养殖室气温控制在 26 ± 1 ℃。
（2）胚胎的获取
收集胚胎的前一天晚上从养殖系统中随机选取健康有活力的斑马鱼（雌雄比例为 2：1）并放在斑马鱼产卵盒中，产卵盒中的水来自养殖系统。并于第二天早上 8：00 收集受精卵。将受精卵在 28 ℃的环境中收集在盛有营养液的无菌培养皿中，用滴管吸出未受精死亡的胚胎并弃置，随后挑选出健康的胚胎用于暴露实验。
储备液配置方法：将0.005g2,6-DCBQ在1mLDMSO中充分溶解后加蒸馏水定容至50mL。随后分装在棕色色谱瓶中，最后于-20℃保存。选择健康的斑马鱼受精卵，随机分布于盛有1L暴露液的2L玻璃烧杯（每个烧杯100枚受精卵）中，每个烧杯中包含不同浓度的2,6-DCBQ（0、0.2、2、20μg/L）。对照组和处理组中DMSO的最终浓度均不超过0.01%（v/v），该剂量不会对斑马鱼的发育和繁殖产生显著影响。在半静态暴露过程中，每隔24h更换2/3体积的暴露液。每个处理组设置三个重复，胚胎置于28±1°C，光暗转换（光照：黑暗）为14h:10h的环境中生长。
斑马鱼胚胎自发卷尾运动测试
斑马鱼胚胎暴露至24hpf时进行自发卷尾运动测试。使用安装在解剖显微镜上的相机进行视频记录，监测每20s胚胎尾部交替弯曲或盘绕次数。每个烧杯（重复组）选取30个胚胎进行观测。
斑马鱼胚胎自发卷尾运动观测视野示意图
斑马鱼触摸激发的逃跑响应能力测试
在胚胎发育至27hpf时，从每个烧杯（重复组）中随机选取10枚胚胎用于逃跑响应能力的测试。27hpf的胚胎通过在含2mg/mL的蛋白酶K溶液中浸泡5min的方式进行脱膜处理。将27hpf脱膜后的胚胎转移至盛水的培养皿中，培养皿置于画有0.38cm×0.38cm小方格的白纸上。使用昆虫针给斑马鱼胚胎尾部施加一个机械刺激，视频录像后分析胚胎的响应能力，将对照组27hpf胚胎所穿越的方格数设为100%（n=30）。
斑马鱼胚胎触摸激发的逃跑响应能力测试示意图
斑马鱼涡旋逃跑率测试
涡旋逃跑率是一种通过观察鱼类对水流的变化评估运动能力的指标。在这个实验中，通过吹打水流形成一个触觉刺激，由于此时鱼类拥有一个完善的游泳能力，所以能够响应这种刺激，从涡旋水流中逃脱出来。当水流变化时，水的压力会通过侧线（鱼类身体两侧高度分化的感觉器官）传递给 Mauthner 感觉神经元，调控斑马鱼的逃逸行为。将80条96hpf仔鱼转移至盛有水的10cm培养皿中，用吸管沿着边缘轻轻吹打水流，使得所有仔鱼聚集于培养皿中间。停止吹打水流后，仔鱼会朝着培养皿边缘游动；当涡旋的水流完全停止时，统计滞留在培养皿中间区域（直径为3cm）和逃离出来的仔鱼个体，将逃离出来的数目除以总共的鱼数（80）即为涡旋逃跑率（n=4）。
斑马鱼胚胎触摸激发的逃跑响应能力测试示意图
斑马鱼仔鱼平均游泳速度测试
光暗转换测试是一种判断鱼类早期生命阶段运动活力的常用实验方法。在该测试中，仔鱼对光强的变化表现出典型的“冻结”反应，活动能力降低；当光线消失时，仔鱼在黑暗中变得相对活跃。采用光暗转换实验评估斑马鱼仔鱼平均游泳速度，具体步骤如下：将7dpf斑马鱼仔鱼轻轻转移至水温为28.5℃的6孔板中（1条仔鱼/孔）并在黑暗条件下适应10min，实验按照以下程序进行：黑暗5min→光照5min→黑暗5min→光照5min→黑暗5min。每个烧杯（重复组）取6条仔鱼。相机记录完毕后，最后通过软件分析视频，跟踪仔鱼的游泳轨迹并计算其自由运动的平均速度，结果表示为cm/min。
斑马鱼仔鱼游泳行为测试示意图（左边为黑暗条件，右边为光照条件）
斑马鱼仔鱼光暗偏好行为测试
光暗偏好行为测试被广泛用来评估鱼类特别是仔鱼的焦虑样应激行为，而焦虑行为的出现会改变鱼类在光区和暗区的停留时间比。将7dpf斑马鱼仔鱼轻轻转移至水温为28.5℃的12孔板中（1条鱼/孔），放于观察箱中，用黑色胶带遮住每个孔的一半，打开光源，使12孔板中的每个孔分为光室跟暗室两部分，适应10min后，对仔鱼的行为进行录像10min。记录完毕后，观察斑马鱼仔鱼每次进入暗室的持续时间。每个暴露组观察36条仔鱼（n=36）。
斑马鱼仔鱼镜像行为测试（幼鱼攻击）
将12dpf的单个仔鱼转移到含10mL水的定制磨砂模具中（长×宽×高：4.2cm×3.9cm×2cm）。记录仔鱼运动6min，每60s收集一次数据。录像完毕后，分析斑马鱼仔鱼对镜子的攻击（弓步，咬）的发生率和在镜像区域（距离镜子≤1.0cm）花费的时间百分比。镜像刺激是一种可重复的、非侵入性的方法，可用来评估斑马鱼仔鱼的攻击性。
参考文献：
1、Beekhuijzen M., De Koning C., Flores-Guillén M. E., et al. From cutting edge to guideline: A first step in harmonization of the zebrafish embryotoxicity test (ZET) by describing the most optimal test conditions and morphology scoring system [J]. Reproductive Toxicology, 2015, 56: 64-76.
2、Gupta V. A., Kawahara G., Myers J. A., et al. A splice site mutation in laminin-α2 results in a severe muscular dystrophy and growth abnormalities in zebrafish [J]. PLoS ONE, 2012, 7(8): e43794.
3、Tao J., Bai C., Chen Y., et al. Environmental relevant concentrations of benzophenone-3 induced developmental neurotoxicity in zebrafish [J]. Science of the Total Environment, 2020, 721: 137686.
4、Liu J., Sun L., Zhang H., et al. Response mechanisms to joint exposure of triclosan and its chlorinated derivatives on zebrafish (Danio rerio) behavior [J]. Chemosphere, 2018, 193: 820-832.
5、Brustein E., Saint-Amant L., Buss R. R., et al. Steps during the development of the zebrafish locomotor network [J]. Journal of Physiology Paris, 2003, 97(1): 77-86.
找实验方法，上脑声常谈
斑马鱼行为实验交流群
扫码邀请入群