光学显微镜的分辨率定义为标本上两点之间的最短距离，观察者或相机系统仍可将其区分为单独的实体。下图（图1）给出了这个重要概念的一个示例，其中来自标本的点光源在显微镜中间像平面上显示为艾里衍射图。
图1-通风模式和分辨率极限显微镜物镜分辨率的极限是指其在衍射图中区分两个紧密排列的艾里斑的能力（图中未注明）。中间像平面附近的衍射图样的三维表示被称为点扩散函数，并在图1的下部进行了说明。标本图像由形成艾里图案的一系列紧密间隔的点光源表示，并在二维和三维图中进行了说明。
在光学显微镜下，分辨率是一个比较主观的值，因为在高放大倍率下，图像可能看起来不清晰，但仍然可以达到物镜的最大能力。数值孔径决定了物镜的分辨能力，但是整个显微镜光学系统的总分辨率也取决于台下聚光镜的数值孔径。整个系统的数值孔径越高，分辨率越好。
交互式程序-数值孔径和图像分辨率探索客观数值孔径大小如何影响Airy盘属性。
显微镜光学系统的正确对准对于确保最大分辨率也至关重要。次级聚光器必须在数值孔径和孔径虹膜光阑的调节方面与物镜相匹配，以实现准确的光锥形成和样品照明。用于对样本成像的光的波长光谱也是显微镜提供的分辨率程度的决定因素。与较长的波长相比，较短的波长能够更大程度地解析细节。已经导出了一些方程式来表达数值孔径，波长和分辨率之间的关系：
分辨率（r）=λ/（2NA）
分辨率（r）=0.61λ/ NA
分辨率（r）=1.22λ/（NA（obj）+ NA（cond））
其中r是分辨率（两个物体之间的最小可分辨距离），NA是显微镜数值孔径的总称，λ是成像波长，NA（obj）等于物镜数值孔径，NA（cond）是聚光镜数值孔径。注意，方程（1）和（2）由所述乘法因子，这是0.5方程不同（1）和0.61方程（2）。这些方程式基于许多因素（包括光学物理学家所做的各种理论计算）来说明物镜和聚光镜的行为，因此不应视为任何一项一般物理定律的绝对值。在某些情况下，例如共聚焦和荧光显微镜，分辨率实际上可能超过了这三个方程式中的任何一个所设定的极限。其他因素，例如较低的样品对比度和不适当的照明，可能会降低分辨率，并且往往会降低r的实际最大值（使用550纳米的中光谱波长，约为0.25 μm），并且数值孔径为在实践中无法实现1.35至1.40。下表（表1）提供了一个列表的分辨率（ř）和数值孔径（NA）值进行物镜放大和校正。
表1-通过物镜校正的分辨率和数值孔径物镜类型平场消色差平场萤石平场复消色差放大数值孔径分辨率（um）数值孔径分辨率（um）数值孔径分辨率（um）4倍0.102.750.132.120.201.37510倍0.251.100.300.920.450.6120倍0.400.690.500.550.750.3740倍0.650.420.750.370.950.2960倍0.750.370.850.320.950.29100倍1.250.221.300.211.400.20NA =数值孔径
当显微镜完全对准并且物镜与次级聚光镜适当匹配时，我们可以将物镜的数值孔径代入方程式（1）和（2），将方程式（3）简化为方程式（2）。要注意的一个重要事实是，在任何这些方程式中，放大率都不是一个因素，因为只有数值孔径和照明光的波长才能确定样品的分辨率。
正如我们已经提到的（在等式中可以看到的），光的波长是显微镜分辨率的重要因素。较短的波长产生较高的分辨率（r的较低值），反之亦然。光学显微镜中最大的分辨力是通过近紫外光实现的，这是最短的有效成像波长。近紫外光之后是蓝色，然后是绿色，最后是红色，可以分辨出样品的细节。在大多数情况下，显微学家使用钨卤素灯泡产生的白光照亮样品。可见光谱的中心位于约550纳米，这是绿光的主要波长（我们的眼睛对绿光最敏感）。表1中就是用来计算分辨率值的波长。数值孔径值在这些方程式中也很重要，数值孔径越高，分辨率也越高。在固定数值孔径（0.95）下，光波长对分辨率的影响，
表2-分辨率与波长波长（nm）分辨率（um）360.19400.21450.24500.26550.29600.32650.34700.37显微镜的分辨能力是光学系统的最重要特征，并且会影响区分特定样本精细细节的能力。如上所述，确定分辨率的主要因素是物镜的数值孔径，但是分辨率还取决于样本的类型，照明的相干性，像差校正的程度以及其他因素，例如光学系统中的对比度增强方法。显微镜或标本本身。归根结底，分辨率与显微镜的有用放大倍率和标本细节的感知极限直接相关。